基于CRISPR技术的非病毒模式的细胞治疗开发凭借其成本低，通量高和更安全的特点，逐渐受到更多关注，也为细胞治疗商业化过程中，暴露出来的慢病毒载体短缺导致产能和推广受限问题，提供了解决方案。
金斯瑞推出“非病毒细胞疗法-CRISPR基因敲入优化试剂盒”，试剂盒包含sgRNA，Cas蛋白 ，单链/双链敲入模板，用于验证和优化T细胞，NK细胞，iPSC等细胞基因敲入效率，推进支持基于CRISPR技术敲入CAR,TCR等序列非病毒细胞治疗开发，具有以下优势：
试剂盒组分
化学合成sgRNA
- HPLC纯化的SafeEdit sgRNA
- TRAC、RAB11A敲入位点可选
高纯度Cas9蛋白
- 野生型（WTSpCas9）和增强型（eSpCas9）均可选择
基因敲入(HDR)模板
- 单链ssDNA/共价闭合双链dsDNA敲入模板可选
- 可添加CTS设计提升敲入效率
基因敲入增强剂（Enhancer）*
- iPSC/T细胞等多种细胞，多个位点验证
- 显著提升敲入效率高达2.4倍
* 欢迎咨询基因敲入增强剂（Enhancer），您可以联系技术支持了解详情或订购，邮箱： oligo@genscript.com.cn ，电话：400-025-8686转5812或5815。
试剂盒定制
1. 请选择您需要的目的基因敲入位点:
- TRAC : 适用于T细胞，常用的CAR序列敲入位点，sgRNA针对TRAC位点的第一个外显子区域设计
- RAB11A : 通用的管家基因，适用于T细胞、NK细胞、巨噬细胞、iPSC细胞等具有RAB11A 位点的更广泛的细胞
- 备注 :其他位点请选择 定制化sgRNA 、 基因敲入（HDR）模板合成服务
2. 请选择您需要的基因敲入模板：
- 野生型Cas9蛋白 : 科研级，包含一个核定位信号（NLS）
- 特异性增加型eSpCas9-2NLS蛋白 : 通过在SpCas9 (K848A/K1003A/R1060A) 两端增加核定位信号（NLS）去提升基因编辑的靶向特异性，更稳定，在提升编辑效率的同时可以降低10倍以上的脱靶效率1
3. 请选择您需要的基因敲入模板：
- GenExact™ ssDNA: 单链模板
- GenWand™ dsDNA: 双端共价封闭双链模板
- GenEaxct™ ssDNA和GenWand™ dsDNA： 推荐同时选择两者，比较选择合适您实验体系的敲入模板类型
4. 您是否需要在您的基因敲入模板上增加CTS序列去提升敲入效率？
(CTS设计提升编辑效率的方案详见文献报告和案例分享
，实验操作详见操作指南)
- 需要 ：CTS序列让 RNP（Cas9+sgRNA）结合至敲入模板两端，促进模板进入细胞核，提升敲入效率，单链模板需要配合退火引物使用
- 不需要
试剂盒产品详情
请查收您的定制化试剂盒，按照《金斯瑞的实验操作指南》的推荐试剂剂量，可以用于约12个反应的实验（Lonza 4D电转平台），或用于25个反应的实验（Neon电转平台），您可以根据您的实验体系和试剂用量增减产品数量，确保每个组分的交付量足够支持您开展实验。
| 货号 | 产品名称 | 数量 |
|---|---|---|
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KIOK1-1.5
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SafeEdit TRAC sgRNA - 1.5 nmol | |
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KIOK1-3
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SafeEdit TRAC sgRNA - 3 nmol | |
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KIOK1-6
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SafeEdit TRAC sgRNA - 6 nmol | |
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KIOK2-1.5
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SafeEdit RAB11A sgRNA - 1.5 nmol | |
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KIOK2-3
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SafeEdit RAB11A sgRNA - 3 nmol | |
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KIOK2-6
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SafeEdit RAB11A sgRNA - 6 nmol | |
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KIOK3-100
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Ultra eSpCas9 - 100 μg | |
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KIOK3-200
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Ultra eSpCas9 - 200 μg | |
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KIOK3-400
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Ultra eSpCas9 - 400 μg | |
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KIOK4-100
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Ultra WTSpCas9 - 100 μg | |
|
KIOK4-200
|
Ultra WTSpCas9 - 200 μg | |
|
KIOK4-400
|
Ultra WTSpCas9 - 400 μg | |
|
KIOK5
|
ssDNA_TRAC_EGFP - 50 μg | |
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KIOK6
|
ssDNA_TRAC_EGFP_CTS - 50 μg | |
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KIOK7
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dsDNA_TRAC_EGFP - 50 μg | |
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KIOK8
|
dsDNA_TRAC_EGFP_CTS - 50 μg | |
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KIOK9
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ssDNA_RAB11A_GFP - 50 μg | |
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KIOK10
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ssDNA_RAB11A_GFP_CTS - 50 μg | |
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KIOK11
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dsDNA_RAB11A_GFP - 50 μg | |
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KIOK12
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dsDNA_RAB11A_GFP_CTS - 50 μg | |
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KIOK13
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TRAC CTS Annealing Oligo - 2 nmol | |
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KIOK14
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RAB11A CTS Annealing Oligo - 2 nmol |
备注：ssDNA选择含CTS模板必须配套使用对应位点的退火引物，dsDNA本身即为双链无需退火
您可以根据实际需求选择加购以下产品：
| 货号 | 产品名称 | 数量 |
|---|---|---|
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KIOK3-100
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Ultra eSpCas9 - 100 μg | |
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KIOK3-200
|
Ultra eSpCas9 - 200 μg | |
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KIOK3-400
|
Ultra eSpCas9 - 400 μg | |
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KIOK4-100
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Ultra WTSpCas9 - 100 μg | |
|
KIOK4-200
|
Ultra WTSpCas9 - 200 μg | |
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KIOK4-400
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Ultra WTSpCas9 - 400 μg |
参考文献
技术资源
常见问题
-
GenExact™ ssDNA
精准敲入、毒性更低的单链模板
应用：细胞治疗、KI细胞系/动物模型构建
优势：
- 细胞毒性低，特别适合T细胞编辑
- 精准敲入，脱靶效应低
- 纯度高、经测序验证
规格：
- 敲入序列长度：150-5,000 nt
- µg to mg级交付量
- 科研至GMP级别
-
应用：长基因敲入、工艺放大/规模量产
优势：
- 两端共价封闭、可实现高效精准敲入
- 适合长基因敲入、大规格更经济
- 纯度高、经测序验证
规格：
- 敲入序列长度：2-10 kb
- µg to g级交付量
- 科研至GMP级别
-
应用：替代传统质粒HDR模板，匹配申报合规性
特点：
- 较之传统质粒HDR模板，敲入效率提升高达30%
- 骨架仅429bp，毒性低，转染效率高
- 删除抗性标记与细菌源序列，规避耐药风险与合规性相关风险
- 纯度高、经测序验证
规格：
- 敲入序列长度：1-50 kb
- µg to g级交付量
- GMP级别规划中
UCSF Marson Lab 开发了一种含CTS设计的敲入模板，在两端添加了Cas9蛋白靶向序列（CTS），两端序列中互补的序列通过退火形成了双链DNA。整个HDR模板中，待插入基因左右两侧为同源臂序列，同源臂序列外端为CTS序列，CTS包含PAM序列、gRNA序列和一段边缘核苷酸序列。
通过这种设计，CTS可以让RNP（Cas9+sgRNA）与敲入模板整合在一起进行电转，促进其进入宿主细胞的细胞核，这种设计可以让基因敲入模板更接近RNP的切割位点，从而提升目标基因插入效率。通过添加CTS设计，GMP适用规模的GenExact™ ssDNA 在未添加增强剂的条件下，敲入效率可高达46.2%（图3）。
