产品简介
慢病毒载体是在 HIV-1 病毒基础上改造而生成的病毒载体系统，可以高效地将目的基因转入到相关的细胞中。 对于HIV-1 衍生的慢病毒载体，常用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测载体样本中的 p24蛋白从而进行物理滴度的检测。
金斯瑞慢病毒滴度p24 ELISA试剂盒拥有超宽检测范围，为31.25到2000 pg/ml。可以有效减小稀释倍数，从而节约检测时间以及减少稀释过程导致的偏差。而且金斯瑞慢病毒滴度p24 ELISA试剂盒仅需2.5小时即可完成测试，100%能在1天内完成样本的多次测试。
产品特点
-
超宽线性范围
拥有31.25 到 2,000 pg/ml的超宽检测线性范围，有效减少稀释倍数。
-
极短检测时间
仅需1小时40分钟即可完成孵育，全程检测用时不到3小时，不再等待。
-
高检测精密度
产品批内差≤ 10%，批间差 ≤ 15%，保证滴度测定精密度。
-
灵活配置
8孔x12条，提供96次检测，可拆卸板条，灵活取用，随取随用。
检测原理
金斯瑞慢病毒滴度p24 ELISA试剂盒利用了两种抗HIV-1病毒p24蛋白的单克隆抗体，它们可与 p24 蛋白的不同表位结合。当标准品或样品加入捕获板时，p24衣壳蛋白可以被包被在捕获板上的抗p24捕获抗体捕获。然后在体系中加入与生物素结合的抗p24检测抗体，该检测抗体可以与捕获板上结合的 p24 蛋白相互作用。随后添加的链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物 (Streptavidin-HRP) 可与生物素偶联的抗 p24 抗体 (Biotin Anti-p24 Antibody) 相互作用。在洗涤步骤后，加入 3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺溶液（TMB溶液），可在体系中形成蓝色复合物。通过添加终止溶液终止反应。终止溶液可使的体系颜色从蓝色变为黄色。颜色的强度可以通过酶标仪在 450 nm 处读取。测试样品中p24蛋白的浓度可根据 p24蛋白标准曲线实现精确定量。最后可通过p24蛋白浓度和慢病毒滴度换算关系计算得出样品中的慢病毒滴度。
Figure 1: 慢病毒滴度p24 ELISA试剂盒检测原理
验证数据
回收率用于确定分析物检测是否受样品基质差异的影响，通过将已知量的分析物加标到不同的样品基质中来验证回收率。以下是根据具有代表性的准确度验证生成的报告和数据示例，在这项验证中，使用3批次试剂盒（Cat. No. L00938, GenScript），将已知量的分析物加标到基质中混合验证回收率，样本重复测量3次。根据性能评估结果，回收率应在80%-120%，则认为样品基质对准确定量分析物的能力影响较小。
Table 1: 三批次试剂盒回收率测试结果
| 批次编号 | 重复次数 | 平均测值 pg/mL | 回收率 | |
|---|---|---|---|---|
| 实测 | 标准: 80%-120% | |||
| #1 | 3 | 1945.30 | 86% | 符合 |
| #2 | 3 | 1787.64 | 108% | 符合 |
| #3 | 3 | 1752.76 | 90% | 符合 |
A. 批内精密度/重复性
批内精密度验证体现测定板内每孔之间的重复性，有助于确保在测定板的不同孔中运行样本检测可以给出可靠的结果。 以下是根据具有代表性的批内精密度验证生成的报告和数据示例，在这项验证中，使用试剂盒（Cat. No. L00938, GenScript）分别对低、中、高3个浓度水平的样本进行测试，每个样本各重复检测10次，每个样本计算10次测量浓度结果的平均值（M）和标准差（SD），计算变异系数(CV)。根据性能评估结果，所测结果 %CV应低于10%，表明该测定具有良好的重复性。
Table 2: 三批次试剂盒批内精密度验证结果
| 批次编号 | 重复次数 | 平均测值 pg/mL | %CV | |
|---|---|---|---|---|
| 实测 | 标准：≤10% | |||
| #1 | 10 | 215.55 | 3% | 符合 |
| #1 | 10 | 829.45 | 4% | 符合 |
| #1 | 10 | 1537.42 | 4% | 符合 |
| #2 | 10 | 209.60 | 5% | 符合 |
| #2 | 10 | 792.76 | 2% | 符合 |
| #2 | 10 | 1431.42 | 3% | 符合 |
| #3 | 10 | 188.09 | 6% | 符合 |
| #3 | 10 | 759.99 | 4% | 符合 |
| #3 | 10 | 1377.71 | 3% | 符合 |
B. 批间精密度
批间精密度体现同一样品在多批测定间的重现性，有助于确保在不同批次试剂盒中运行样本检测可以给出可靠的结果。 以下是根据具有代表性的批间精密度验证生成的报告和数据示例，在这项验证中，使用3个不同批次试剂盒（Cat. No. L00938, GenScript）分别对低、中、高3个浓度水平的样本进行测试，每个样本各重复检测10次，每个样本计算30次测量浓度结果的平均值（M）和标准差（SD），计算变异系数(CV)。根据性能评估结果，所测结果 %CV应低于15%，表明该测定具有良好的批间精密度。
Table 3: 三批次试剂盒批间差验证结果
| 批次数量 | 重复次数 | 平均测值 pg/mL | %CV | |
|---|---|---|---|---|
| 实测 | 标准：≤15% | |||
| 3 | 3×10 | 204.41 | 7% | 符合 |
| 3 | 3×10 | 794.07 | 5% | 符合 |
| 3 | 3×10 | 1448.85 | 6% | 符合 |
使用慢病毒滴度p24试剂盒对慢病毒纯化生产全流程进行慢病毒滴度监测，有利于慢病毒纯化和成产过程控制和优化。金斯瑞慢病毒滴度p24试剂盒（Cat. No. L00938, GenScript）的超宽线性可以有效减小稀释倍数，从而节约检测时间以及减少稀释过程导致的偏差。
Table 4a: 金斯瑞慢病毒滴度p24试剂盒在慢病毒纯化生产全流程的滴度检测
| 样品名称 | 样品OD值 | 样品检测值 (pg/mL) | 稀释倍数 | p24浓度 (LP/mL) | CV % |
|---|---|---|---|---|---|
| HM上清液 | 3.151 | 2445.918 | 100 | 超出检测范围，无效 | / |
| 1.225 | 444.343 | 3000 | 1.67E+10 | ||
| PB核酸酶孵育 | 3.12 | 2369.055 | 100 | 超出检测范围，无效 | / |
| 1.242 | 451.997 | 3000 | 1.69E+10 | ||
| Centrifugation离心 | 3.103 | 2328.92 | 100 | 超出检测范围，无效 | / |
| 0.94 | 321.172 | 3000 | 1.20E+10 | ||
| CF-01澄清过滤 | 3.136 | 2405.64 | 100 | 超出检测范围，无效 | / |
| 0.926 | 315.765 | 3000 | 1.18E+10 | ||
| UF/DF浓缩换液 | 2.183 | 1040.264 | 3000 | 3.90E+10 | 3 |
| 0.152 | 36.234 | 90000 | 4.08E+10 | ||
| CF-02澄清过滤 | 1.994 | 890.168 | 3000 | 3.34E+10 | 6 |
| 0.142 | 32.441 | 90000 | 3.65E+10 | ||
| GF凝胶过滤 | 1.496 | 578.496 | 3000 | 2.17E+10 | / |
| 0.106 | 18.902 | 90000 | 超出检测范围，无效 | ||
| UF/DF-02浓缩换液 | 2.623 | 1501.37 | 3000 | 5.63E+10 | 3 |
| 0.185 | 47.906 | 90000 | 5.39E+10 | ||
| 最终样 | 3.155 | 2459.286 | 3000 | 超出检测范围，无效 | / |
| 0.799 | 265.916 | 90000 | 2.99E+11 |
Table 4b: 竞品慢病毒滴度p24试剂盒在慢病毒纯化生产全流程的滴度检测
| 样品名称 | 样品检测值 (pg/mL) | 样品OD值 | 稀释倍数 | p24浓度 (LP/mL) | CV % |
|---|---|---|---|---|---|
| HM上清液 | 86.687 | 1.223 | 12000 | 1.30E+10 | / |
| 291.899 | 3.143 | 2000 | 超出检测范围，无效 | ||
| PB核酸酶孵育 | 100.254 | 1.375 | 12000 | 1.50E+10 | / |
| 282.872 | 3.073 | 2000 | 超出检测范围，无效 | ||
| Centrifugation离心 | 73.79 | 1.073 | 12000 | 1.11E+10 | / |
| 275.974 | 3.019 | 2000 | 超出检测范围，无效 | ||
| CF-01澄清过滤 | 69.953 | 1.028 | 12000 | 1.05E+10 | / |
| 279.996 | 3.051 | 2000 | 超出检测范围，无效 | ||
| UF/DF浓缩换液 | 234.108 | 2.675 | 10000 | 超出检测范围，无效 | / |
| 39.453 | 0.653 | 60000 | 2.96E+10 | ||
| CF-02澄清过滤 | 212.127 | 2.484 | 10000 | 超出检测范围，无效 | / |
| 36.317 | 0.612 | 60000 | 2.72E+10 | ||
| GF凝胶过滤 | 165.17 | 2.048 | 10000 | 2.06E+10 | 5 |
| 29.342 | 0.522 | 60000 | 2.20E+10 | ||
| UF/DF-02浓缩换液 | 275.001 | 3.011 | 10000 | 超出检测范围，无效 | / |
| 69.346 | 1.021 | 60000 | 5.20E+10 | ||
| 最终样 | 38.46 | 0.64 | 480000 | 2.31E+11 | / |
| 244.786 | 2.765 | 80000 | 超出检测范围，无效 |
* 红色标记数据为超出检测范围数据
在慢病毒纯化生产的工艺开发过程中，9个工艺过程的18个样品被采集并进行滴度检测。实验结果发现： 1. 金斯瑞慢病毒滴度p24检测试剂盒的稀释倍数低于用竞品的p24检测试剂盒的稀释倍数。 2. 在稀释慢病毒到慢病毒滴度p24检测试剂盒的线性范围的过程中，18个样品使用金斯瑞慢病毒滴度p24检测试剂盒一次稀释成功率为 67%，而使用竞品p24检测试剂盒一次稀释成功率为 56%。
