Kit方法开发与验证

金斯瑞PK/ADA检测试剂盒根据FDA和NMPA法规要求进行方法开发和验证，精密度根据CLSI EP05-A3指导性文件进行评估，确保其准确性和可靠性。试剂盒可以满足临床前、临床研究期间PK和ADA研究需求。

• 试剂盒验证指标
  

  金斯瑞PK试剂盒与常规RUO定量试剂盒的对比

  

  金斯瑞ADA试剂盒与常规RUO定量试剂盒的对比

• 试剂盒反应原理图
  

  图. 药代动力学ELISA试剂盒

  

  图. 免疫原性试剂盒(Bridging ELISA)

  

  图. ADC 药代动力学ELISA试剂盒

应用案例

• PK -- L00968 Pembrolizumab 药代动力学ELISA试剂盒
  

  图1. 理想的标准曲线
  设置6个浓度点，标准曲线范围160-2.5 ng/mL（MRD（Minimum Required Dilution）=1:100前的浓度），灵敏度：5 ng/mL。

  

  图2. 高选择性
  图中虚线代表准确度80%和120%临界线；
  HQC（高质控）水平选择性：100%不同来源的空白个体基质的准确度80.5%～105%，精密度0.9%～6.4%；
  LLOQ（定量下限）水平选择性：90%不同来源的空白个体基质的准确度95.8%～116.8%，精密度1.0%～10.6%；
  不同来源的空白个体基质：10个不同来源的空白个体基质信号值都低于LLOQ信号值。

  

  图3. 高特异性
  添加Human IgG4（1600 ng/mL），Pembrolizumab 在ULOQ（定量上限）和LLOQ（定量下限）水平准确度85.6%～113.8%，精密度2%～5.1%；
  添加Human IgG4（160 ng/mL），Pembrolizumab在ULOQ和LLOQ水平准确度89.1%～111.9%，精密度0.4%～0.5%。

  表1. 试剂盒精密度

  质量 控制	Pembrolizumab标示值 (ng/mL)	批内 (n=10)			批间 (n=30)
  		Pembrolizumab测量值(ng/mL)	CV %	准确度 %	Pembrolizumab测量值 (ng/mL)	CV %	准确度 %
  P1	120	102.41	6.92	85.34	105.08	2.65	87.57
  P2	30	29.58	3.88	98.61	31.00	0.83	103.33
  P3	15	16.64	2.99	110.96	17.77	2.71	118.49

  试剂盒精密度：批内精密度＜7%，批间精密度＜3 %。

  表2. 钩状效应分析

  Pembrolizumab标示值 (ng/mL)	吸光度 (OD 450/630nm)			CV %
  	重复1	重复2	平均值
  15,000	5.845	5.323	5.584	6.60
  1,500	5.881	5.611	5.746	3.33
  750	5.505	5.583	5.544	0.99

  3个高于ULOQ的样品浓度的准确性不受钩状效应（即由高浓度待测物引起的信号抑制）的影响。

  表3. 良好的稀释线性

  稀释比	Pembrolizumab标示值 (ng/mL)	Pembrolizumab测量值 (ng/mL)	CV %	准确度 %
  1:2,000	7.5	8.496	0.28	113.28
  1:1,000	15	17.215	2.27	114.77
  1:100	15	15.406	1.21	102.71
  1:50	15	15.597	2.92	103.98

  通过4个不同的稀释比（稀释因子）对标准品进行稀释，经稀释因子校正后，每个稀释标准品的准确度102.7%～114.8%，精密度0.28%～2.9%。

• ADA -- L00971 Pembrolizumab 免疫原性试剂盒(Bridging ELISA)
  

  图4. 严格的阳性对照抗体筛选
  4株抗体通过筛选试验确定灵敏度都大于20 ng/mL，再通过确证试验证明4株抗体都可以作为阳性对照抗体，根据筛选和确证结果选择灵敏度高的抗体作为试剂盒最终选定的阳性对照抗体。

  

  图5. 理想的标准曲线
  设置6个浓度点，标准曲线范围50-0.78 ng/mL（MRD=1:5前的浓度），灵敏度:1.56 ng/mL。

  

  图6. MRD分析
  当MRD=1:5时，混合基质配制的样本信号值最接近样本稀释液配制的样本信号值。

  

  图7. 高选择性
  图中虚线为筛选临界值线；
  LQC（低质控）水平选择性：87%不同来源的空白个体基质的精密度0.2%～8.5%，信号值不低于筛选临界值；
  空白水平选择性：87%不同来源的空白个体基质的精密度0.6%～14.3%，信号值低于筛选临界值。

  

  图8. 钩状效应分析
  随着Anti-Pembrolizumab浓度的升高信号值升高，高浓度样本信号值均高于标曲高点信号值，且信号值没有出现抑制的现象，在测试浓度范围内，没有出现HOOK效应。

  表4. 试剂盒的批内批间精密度

  样本	抗Pembrolizumab标示值 (ng/mL)	批内 (n=10)			批间 (n=30)
  		测量值 (ng/mL)	CV %	准确度 %	测量值 (ng/mL)	CV %	准确度 %
  P1	50	49.27	3.26	98.54	50.96	3.51	102.07
  P2	7.5	7.75	4.27	103.37	8.22	4.17	110.32
  P3	2.5	2.15	7.27	85.81	2.39	8.07	95.40

  试剂盒精密度：批内精密度＜8%，批间精密度＜9%。

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