产品简介
腺相关病毒（AAV）是目前广泛用于基因治疗的病毒载体，其中AAV2是研究最为广泛的血清型。当使用AAV2作为基因治疗的病毒载体时，确定纯化的AAV2颗粒滴度是一个重要的表征环节，也是临床应用的一个关键步骤。
金斯瑞AAV2滴度衣壳蛋白ELISA试剂盒可用于病毒载体生产过程中定量测量AAV2样本中总衣壳蛋白浓度。该ELISA试剂盒使得AAV2滴度测定更简单、准确和可重复。
产品特点
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超宽线性范围
产品检测线性范围为4.8×107 to 2.5×109 Capsids/mL。
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自带AAV2质控品
ELISA试剂盒产品自带AAV2质控品，无需单独购买。
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高检测精密度
产品批内差≤ 10%，批间差 ≤ 15%，保证滴度测定精密度。
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灵活配置
8孔x12条，提供96次检测，可拆卸板条，灵活取用，随取随用。
检测原理
金斯瑞AAV2滴度衣壳蛋白ELISA试剂盒利用了两种抗AAV2衣壳蛋白的单克隆抗体，它们可与衣壳蛋白的不同表位结合。
当标准品或样品加入捕获板时，AAV2衣壳蛋白可以被包被在捕获板上的抗衣壳蛋白捕获抗体捕获。然后在体系中加入与生物素结合的抗衣壳蛋白检测抗体，该检测抗体可以与捕获板上结合的衣壳蛋白相互作用。随后添加的链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物 (Streptavidin-HRP) 可与生物素偶联的抗衣壳蛋白抗体 (Biotin Anti-AAV2 Antibody) 相互作用。在洗涤步骤后，加入 3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺溶液（TMB溶液），可在体系中形成蓝色复合物。通过添加终止溶液终止反应。终止溶液可使的体系颜色从蓝色变为黄色。颜色强度可以通过酶标仪在 450 nm 和 650 nm 处读取。测试样品中衣壳蛋白的浓度可根据衣壳蛋白标准曲线实现精确定量。
Figure 1: AAV2滴度衣壳蛋白ELISA试剂盒检测原理
验证数据
回收率用于确定分析物检测是否受样品基质差异的影响，通过将已知量的分析物加标到不同的样品基质中来验证回收率。以下是根据具有代表性的准确度验证生成的报告和数据示例，在这项验证中，使用3批次试剂盒（Cat. No. L00942, GenScript），将已知量的分析物加标到基质中混合验证回收率，样本重复测量3次。根据性能评估结果，回收率应在80%-120%，则认为样品基质对准确定量分析物的能力影响最小。
Table 1: 三批次试剂盒回收率测试结果
| 批次 | 重复次数 | 平均测值 Capsids/mL | 回收率 | |
|---|---|---|---|---|
| 实测 | 标准: 80%-120% | |||
| #1 | 3 | 1.99E+09 | 93% | 符合 |
| #2 | 3 | 2.05E+09 | 117% | 符合 |
| #3 | 3 | 1.86E+09 | 95% | 符合 |
A. 批内精密度/重复性
批内精密度验证体现测定板内每孔之间的重复性，有助于确保在测定板的不同孔中运行样本检测可以给出可靠的结果。 以下是根据具有代表性的批内精密度验证生成的报告和数据示例，在这项验证中，使用试剂盒（Cat. No. L00942, GenScript）分别对低、中、高3个浓度水平的样本进行测试，每个样本各重复检测10次，每个样本计算10次测量浓度结果的平均值（M）和标准差（SD），计算变异系数(CV)。根据性能评估结果，所测结果 %CV应低于10%，表明该测定具有良好的重复性。
Table 2: 三批次试剂盒批内精密度验证结果
| 批次编号 | 重复次数 | 平均测值Capsids/mL | %CV | |
|---|---|---|---|---|
| 实测 | 标准：≤10% | |||
| #1 | 10 | 1.37E+08 | 5% | 符合 |
| #1 | 10 | 4.71E+08 | 3% | 符合 |
| #1 | 10 | 1.87E+09 | 4% | 符合 |
| #2 | 10 | 1.65E+08 | 3% | 符合 |
| #2 | 10 | 5.15E+08 | 2% | 符合 |
| #2 | 10 | 1.99E+09 | 3% | 符合 |
| #3 | 10 | 1.41E+08 | 5% | 符合 |
| #3 | 10 | 4.64E+08 | 4% | 符合 |
| #3 | 10 | 1.79E+09 | 5% | 符合 |
B. 批间精密度
批间精密度体现同一样品在多批测定间的重现性，有助于确保在不同批次试剂盒中运行样本检测可以给出可靠的结果。 以下是根据具有代表性的批间精密度验证生成的报告和数据示例，在这项验证中，使用3个不同批次试剂盒（Cat. No. L00942, GenScript）分别对低、中、高3个浓度水平的样本进行测试，每个样本各重复检测10次，每个样本计算30次测量浓度结果的平均值（M）和标准差（SD），计算变异系数(CV)。根据性能评估结果，所测结果 %CV应低于15%，表明该测定具有良好的批间精密度。
Table 3: 三批次试剂盒批间差验证结果
| 批次数量 | 重复次数 | 平均测值Capsids/mL | %CV | |
|---|---|---|---|---|
| 实测 | 标准：≤15% | |||
| 3 | 3×10 | 1.47E+08 | 9% | 符合 |
| 3 | 3×10 | 4.83E+08 | 5% | 符合 |
| 3 | 3×10 | 1.88E+09 | 6% | 符合 |
根据AAV2滴度衣壳蛋白ELISA试剂盒产品手册中的操作指南进行相关AAV滴度测定。将血清型1、2、5、6、8、9和DJ的AAV空载衣壳蛋白作为样品，以各自不同的浓度添加到ELISA试剂盒微孔板中。检测得到的OD值如下。
| 血清型 | 衣壳蛋白浓度 | 吸光度 (450/650 nm) | ||
|---|---|---|---|---|
| (Capsids/mL) | 重复 1 | 重复 2 | 平均值 | |
| AAV 1 | 1.07E+10 | 0.0124 | 0.0118 | 0.0121 |
| AAV 2 | 1.20E+10 | 4.975 | 5.0119 | 4.99345 |
| AAV 5 | 4.29E+10 | 0.0149 | 0.0128 | 0.01385 |
| AAV 6 | 3.13E+10 | 0.0169 | 0.0153 | 0.0161 |
| AAV 8 | 2.31E+10 | 0.0162 | 0.013 | 0.0146 |
| AAV 9 | 1.22E+10 | 0.0138 | 0.014 | 0.0139 |
| AAV DJ | 1.48E+10 | 0.0138 | 0.0131 | 0.01345 |
| 空白对照（仅缓冲液） | 0 | 0.0134 | 0.0114 | 0.0124 |
AAV2衣壳蛋白样本的OD值高于空白对照的OD值，而所有其他测试血清型的AAV衣壳蛋白样本的OD值都在背景范围内。AAV2滴定衣壳蛋白ELISA试剂盒为AAV2滴定进行了特定校准，不能应用于其他血清型的AAV的滴定测定。
