GenCRISPR基因组编辑服务

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GenCRISPR™ 基因编辑细胞系服务

CRISPR被认为是研究和发现药物的强大的工具，可以在不引入外来DNA的情况下，以高度定向的方式改变任何细胞中的任何基因。CRISPR/Cas9相对于以前的基因编辑形式，如TALENs和锌指核酸酶(ZFN)的优点是，它更容易操作，并且在执行双等位基因修改方面具有更高的效率。

金斯瑞提供基于GenCRISPR™的基因编辑服务，可以使用任何哺乳动物细胞系，针对任何基因生产基因编辑的细胞。

服务内容

金斯瑞提供多种CRISPR基因编辑细胞系，依托优势的化学合成长单链sgRNA，可采用编辑效率高、毒性低的RNP递送体系，同时支持慢病毒、质粒多种递送体系，为您提供指定目的基因、编辑区域和细胞的基因编辑细胞系服务。

服务类型	服务详情	细胞系选项*	交付内容**	交付周期
EZ knock-out 细胞系服务	单基因knock-out稳定细胞系	90+种常见适合转染的细胞系（包括A549, CHO-K1, HT-29, MDA-MB-231, 4T1, A20, HCT116, MCF7, MDCK, U937, RPMI 8866等）	2个经测序验证的全等位基因敲除细胞系 1个阴性敲除细胞池对照	9~15周
定制化knock-out 细胞系服务	单基因或多基因knock-out稳定细胞系	任何癌细胞系	1-2个经测序验证的全等位基因敲除细胞系 1个阴性敲除细胞池对照	12~19周
全长基因敲除细胞系服务^New	敲除整个基因片段	50+种常见适合转染的细胞系（包括A549, CHO-K1, HEK293, HEK293T, HT-29, MDA-MB-231, 4T1, A20, HCT116, MCF7等）	1个经测序验证的全等位基因删除细胞系 1个阴性敲除细胞池对照	12~20周
Knock-out 细胞池服务	单基因knock-out细胞系	任何细胞系	经测序验证的含knock-out克隆的细胞池	5-11周
定制化knock-in 细胞系服务	任意基因组位置插入或修饰基因	任何癌细胞系	1个经测序验证的全等位基因敲入细胞系 1个未修饰对照细胞	14-24周
定制化筛选和脱靶效应检测^New	利用全基因组文库或定制化文库筛选目的基因利用iGUIDE进行潜在脱靶效应检测	任何癌细胞系	分析报告	详询

*一般由客户提供细胞系，如果金斯瑞提供细胞系，则需额外收费。且金斯瑞不提供原代细胞、干细胞或IPS细胞的基因编辑服务。

**根据要求在mRNA或蛋白水平验证全等位基因修饰细胞系。两周一次的项目更新。

附加服务	详情
逆转录PCR（RT-PCR）	通过RT-PCR进行测序，验证敲除克隆在CDS上插入缺失标记的mRNA水平。
Western blot	通过WB验证敲除克隆，必须在宿主细胞中提供与靶蛋白（RNAi或敲除）特异性结合的有效抗体。
FACS分析	通过FACS验证敲除克隆，必须在宿主细胞中提供与靶蛋白（RNAi或敲除）特异性结合的有效抗体。
启动子活性分析	宿主细胞中启动子（Cbh/CMV/EFS）的活性分析提升gRNA-Cas9的切割效率。
转染方法优化	难转染细胞转染方法的分析提升gRNA-Cas9的切割效率。
脱靶分析	通过对前5个潜在的脱靶位点进行测序来确定基因敲除克隆
附加单克隆	从同一个细胞库中挑选出另外一个单克隆发给客户。

在4号外显子中通过插入缺失，敲除人类结肠癌细胞HCT116中的K-ras位点，如图1所示。
对Cas9和gRNA递送颗粒进行慢病毒包装，HCT116细胞进行病毒滴度优化。对每个单克隆进行Sanger测序，选择K-ras基因在第4号外显子上敲除的纯合子，如图2所示。
通过Western Blot方法验证所选克隆中K-ras基因表达缺失，如图3所示。

图1：K-ras敲除方法

图2：亲代细胞和K-ras-/- HCT116细胞sanger测序

图3：K-ras敲除蛋白表达验证

设计并合成gRNA，以靶向GS等位基因上的特定区域。用该载体转染DG44细胞，并通过Sanger测序分析细胞池。
获得了几个单克隆并进行Sanger序列分析。一个单克隆包含移码突变（图1）。
分析GS敲除克隆的GS蛋白表达（图2）。
为了评估功能丧失，在有或没有谷氨酰胺浓度增加的情况下培养GS敲除克隆（图3）。在没有谷氨酰胺的情况下GS敲除克隆不能生长。在增加谷氨酰胺时GS敲除克隆生长，因此确定GS敲除细胞系的功能缺失。
总之，成功靶向GS产生的单克隆已完全验证GS功能的缺失。