FAQ–His标签蛋白的纯化

故障排除–His标签蛋白的纯化

问题
可能原因
解决方案
蛋白不结合
层析柱在缓冲液中未充分平衡。
重复或者延长平衡步骤。
蛋白质沉淀在层析柱滤膜上。
清洁层析柱,更换或清洁滤膜。
纯化缓冲液中含有螯合剂,如EDTA或EGTA。
准备新的不含螯合剂的缓冲液。
组氨酸标签埋藏在蛋白质内部,在天然条件下无法结合。
使用其他融合标签,或者尝试将组氨酸标签融合到蛋白质的另一端。
产量低
纯化缓冲液和洗杂缓冲液中咪唑的浓度较高,导致样本与填料的结合亲和力较弱。
优化咪唑浓度,使其适用于您的蛋白质纯化。
蛋白酶降解。
添加蛋白酶抑制剂。
蛋白仍结合在填料的配基上。
尝试更高浓度的咪唑洗脱。
高流速可能会减少蛋白的结合时间,使蛋白在流穿过程中丢失。
流速对蛋白质结合至关重要。使用较低的流速,或尝试批量孵育。
层析柱过载会降低蛋白得率。
推荐蛋白上样量保持在层析柱体积的50–75%。
纯度低
宿主蛋白中含有多个串联组氨酸残基,它们可以与镍柱产生弱结合并和目的蛋白一起洗脱下来。
在裂解液和Wash Buffer中加入低浓度咪唑以洗脱非特异性结合蛋白。
宿主伴侣蛋白(HCP)是一种常见的污染物。
MgCl2和ATP可用于去除HCP。

故障排除–GST标签蛋白的纯化

问题
可能原因
解决方案
纯化的GST融合蛋白的产量低或检测不到
融合蛋白形成包涵体。
在较低温度(20-30°C)下培养细菌,或将诱导蛋白质的IPTG终浓度降低至0.1mM,或减少诱导时间。
在纯化之前,适当溶解包涵体。
融合蛋白不能有效地与谷胱甘肽树脂结合。
进行批量孵育, 将含有GST融合蛋白溶液与谷胱甘肽树脂孵育2小时或更长时间(或者过夜),然后将孵育混合物上样到层析柱上。
融合蛋白不含有活性的GST。
使用温和的超声处理条件或其他裂解方法,例如溶菌酶,使GST不变性。
融合蛋白被蛋白酶降解。
在裂解液和Wash Buffer中加入适当的蛋白酶抑制剂,如PMSF。
融合蛋白不能有效地洗脱出来。
增加洗脱时间或将洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度增加到15 mM或更高。
在不增加谷胱甘肽浓度的情况下将洗脱缓冲液的pH值调节至8.0-9.0。
向洗脱缓冲液中加入Triton X-100(终浓度0.1%)或n-Octylglucoside(终浓度2%)或NaCl(终浓度0.1-0.2M)。
在洗脱蛋白中观察到杂带
融合蛋白被蛋白酶降解。
在裂解液和Wash Buffer中加入适当的蛋白酶抑制剂(或抑制剂混合物),如PMSF。
一些宿主蛋白比如伴侣蛋白可能与融合蛋白相互作用。
在Wash Buffer中加入DTT(终浓度5mM)。纯化前,将重组蛋白溶液用伴侣蛋白缓冲液(2 mM ATP、10 mM MgSO4、50 mM Tris-HCl)37°C孵育10分钟。
过度超声会导致一些蛋白质与融合蛋白结合。
使用较温和的超声条件或其他裂解方法。
一些蛋白质会非特异性地与融合蛋白或珠子结合。
优化洗脱条件。可加入1% Triton X-100、1% Tween-20、0.03% SDS或0.1% NP-40等去垢剂减少非特异性结合。也可以优化洗脱Buffer中的盐浓度以减少非特异性结合。

故障排除–抗体纯化

问题
可能原因
解决方案
层析柱的流速非常低(<0.5 mL/分钟)
缓冲液的微小气泡或来自样品的颗粒会阻塞凝胶孔。
将缓冲液和样品排气,纯化过程避免层析柱干燥。
已上大量样品,但未检测到特异性目标抗体
目标抗体的浓度非常低。
使用与树脂偶联的特异性抗原纯化抗体(High-Affinity Iodoacetyl Resin,货号L00403)。
抗体降解
该抗体可能对低pH洗脱缓冲液敏感。
洗脱后立即用中和缓冲液中和洗脱的馏分。
在任何洗脱成分中均未检测到抗体
该IgG亚类可能不与填料结合。
尝试使用其他亲和色谱介质来纯化抗体,例如Protein G Resin或Protein L Resin。

故障排除–免疫沉淀反应

问题
可能原因
解决方案
高背景
IP过程中洗涤不完全。
增加洗涤次数并延长洗涤时间。金斯瑞纯化磁珠可有效避免高背景产生。
IP过程中的蛋白质降解。
裂解样品时加入新鲜制备的蛋白酶抑制剂。
非特异性结合
琼脂糖珠的结构会吸收非特异性蛋白质。
在免疫沉淀前将琼脂糖珠与裂解物进行预孵育。使用金斯瑞的MagBeads可消除这一步。
未检测到目标蛋白
样品中目标蛋白的表达水平较低。
增加裂解液的上样量。

eStain®蛋白染色仪常见问题

eBlot™ L1快速湿转仪常见问题

  • 1. eBlot™ L1快速湿转仪和传统湿转相比区别是什么?

    传统湿法转印耗时长、操作繁琐;eBlot™ L1快速湿转仪基于湿转的原理,集合了传统湿转稳定、均匀和半干转快速、高效的优势,同时避免了传统湿转耗时费力和半干转不均匀稳定性差的缺点,仪器自带三个预设程序,能够在9-17分钟内快速高效地实现蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到PVDF膜或NC膜上的过程。

  • 2. 蓝、绿、白三个接口分别对应什么溶液?

    蓝色buffer1:转膜液,绿色buffer2:冷却液(推荐使用1%转膜液或纯水),白色:废液。

  • 3. eBlot™ L1快速湿转仪出厂默认程序有哪些?

    仪器中自带三个预设程序,Short:2×5min,Standard:3×5min,Long:4×5min,Method 4清洗程序,Method 1-3出厂未设定,客户可根据自身实验情况设置

  • 4. eBlot™ L1的功率多大?

    400W

  • 5. 海绵可以重复利用吗?

    海绵使用后会变薄,可能导致三明治结构不紧条带转飘、仪器报错等情况

  • 6. 海绵上有很多气孔,会对实验结果有影响吗?

    海绵上有小气孔是正常的,不会影响实验结果;如果出现气孔完全穿透海绵的情况,请联系售后:cpbu.techsupport@genscript.com

  • 7. 转膜后海绵下半部分浸湿了,上半部分是“干”的?

    转膜过程中转膜夹竖直放置,转膜结束后,海绵上的液体受重力作用向下流淌,造成上半部分仍是干燥的错觉,但实际上在转膜过程中是充分浸润的

  • 8. 仪器开机后,主界面出现“Accumulated XXX run time exceeds maximum”怎么处理?

    按任意键解除,仪器可以继续工作不影响使用;该提示可能是仪器PUMP、valve(1)、valve(2)、 valve(3)、channel A、channel B部分使用寿命已经达到预定最大值,建议及时联系工程人员确认是否需要维护,以免造成不必要的损失

  • 9. 仪器开机后出现Incomplete program found怎么处理?

    开机检测到在上次关闭仪器前有未完成的程序,安全起见,通道进行强制排液,因此无需任何操作,需等待仪器检测运行结束,仪器将自动跳转主界面

  • 10. 仪器清洁维护的频率及方法?

    定时清洁维护仪器可以预防仪器报错、吐泡等问题,延长仪器使用寿命;

    转膜夹维护:每次转膜完成后,用流水冲洗转膜夹四面晾干保存; 建议1个月除锈一次,若夹子生锈严重可视情况增加除锈次数,将柠檬酸(192g柠檬酸或210g一水柠檬酸)溶解到 1L 纯水中,配制成 1M 除锈剂,将夹子浸泡其中8 h或者过夜,用刷子除锈后,用水冲洗夹子晾干;

    eBlot™ L1仪器维护:通道完成30片凝胶转膜后,需要对通道和管路进行清洗,每次约5min;

    • 1) 同时按下 UP 和 SETTING 键直至蜂鸣器蜂鸣,仪器进行管路排空;
    • 2) 准备1L 0.1M NaOH溶液(4g NaOH溶于1L ddH2O);
    • 3) 设定A通道和B通道运行程序:(操作步骤:在主界面长按SETTING直到蜂鸣器鸣叫,进入程序选择界面,按UP/DOWN选择Method 4程序,长按SETTING按键进入详细参数界面检查程序是否与下表一致,Buffer 1 cycles设定为4,每个循环设定为0 min,Buffer 2 cycles为0,Cooling cycles为0,First buffer为buffer 1,长按SETTING保存,仪器返回主界面,对应通道名称显示为Method 4,A、B两通道都需设定);
    • 程序名称 程序内容
      Method 4 Buffer 1 4 times
      Cycle 1 0min
      Cycle 2 0min
      Cycle 3 0min
      Cycle 4 0min
      Buffer 2 0 times
      Cooling cycles 0 times
      First buffer Buffer1
    • 4) 将对应蓝色进液管插入0.1 M NaOH溶液中;
    • 5) 在2个转膜夹中分别放置2块干海绵(放置2块干海绵是清洗过程中不报错的关键),将装有海绵的转膜夹分别插入仪器通道A和通道B中;
    • 6) 通道A和通道B同时运行清洗程序;
    • 7) 清洗程序运行结束后,同时按下UP、SETTING直至蜂鸣器蜂鸣,通道显示倒计时,仪器进行管路排空;
    • 8) 将2个转膜夹中的湿海绵换成2块干海绵,分别插入仪器通道A和通道B中将进液管插入纯水中,运行清洗程序(注意:如果没有更换干海绵,可能有水外溢出来,请及时长按START终止程序;如果出现not enough buffer报错,先单击SETTING回到主界面,再单击START,仪器重新进液;若再次出现not enough buffer报错,先单击 SETTING 回到主界面,再长按START终止程序,更换新的海绵,重新运行程序);
    • 9) 清洗程序运行结束后,同时按下UP、SETTING直至蜂鸣器蜂鸣,仪器进行管路排空;
    • 10) 将进液管插到转膜液瓶上,将程序改为正常转膜程序,通道以及管路清洗工作完成。

    必要时可重复步骤2-7,进行1-3次清洗。

    长时间不使用仪器:如果长时间不使用仪器,请在连续运行2次管路排空操作(同时长按UP+SETTING)后断开电源,并将转膜液瓶盖换为密封式瓶盖,防止液体挥发。

    仪器搬动:仪器正常使用后,需要搬动仪器,请确定仪器开机后可以进入主界面,并确认通道内无液体,仪器搬动过程中,请确保仪器水平,防止通道或管路内残余液体洒出。

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