组氨酸标签（His-tag）蛋白分离纯化精品（L00666/L00885/L00776）
组氨酸标签（His-tag）是由6个组氨酸组成的短肽，分子量很小，不会遮盖融合蛋白中其他蛋白的表位和结构域，也不会影响蛋白的结构和功能。带有His标签的蛋白，与琼脂糖凝胶或磁珠上的螯合金属离子Ni2+形成配位键特异性的结合，而被纯化。金斯瑞提供His标签蛋白分离纯化的镍填料、镍磁珠和镍填料预装柱等，用于His标签蛋白的分离纯化。
Ni2+离子的螯合剂有：三配位的亚氨基二乙酸（IDA）、四配位的氮川三乙酸（NTA）和五配位的三(羧甲基)乙二胺(TED)。蛋白质的吸附量的排列顺序为：IDA>NTA>TED；还原剂的耐受力的排列顺序为:TED>NTA> IDA。
螯合金属Ni2+离子的螯合剂是偶联在琼脂糖凝胶介质上的，一般4%的琼脂糖凝胶基质适用于手动或蠕动泵的重力柱纯化，金斯瑞提供的填料有Ni-IDA亲和层析介质（ L00223I）、Ni-NTA纯化介质（ L00250）。一般6%的琼脂糖凝胶基质可耐受0.3MPa压力，适用于AKTA等纯化设备，金斯瑞提供的填料有：Ni-IDA Resin FF（ L00465）、 Ni-NTA填料High Affinity Ni-Charged Resin FF（ L00666）、Ni-TED填料High Affinity Ni-TED Resin FF ( L00885），预装柱有：Ni-IDA Resin FF预装柱（ L00684）和Ni-NTA预装柱High Affinity Ni-Charged Resin FF Prepacked Column（ L00683）。
镍填料
Ni-NTA填料
High Affinity Ni-Charged Resin FF（L00666）是一种6%高交联琼脂糖基质，共价偶联螯合剂NTA，通过四个配位键结合Ni2+，高亲和性纯化多组氨酸标记的重组蛋白。High Affinity Ni-Charged Resin FF具有低的Ni2+泄漏，高的蛋白质结合能力和稳定性，并可耐受蛋白质纯化中多种化学试剂。这使得 Ni-NTA 填料成为了纯化6x His标签融合蛋白的最佳选择。
表1. Ni-NTA亲和层析介质的特性
| 骨架基质 | 6%交联的琼脂糖凝胶 |
| 平均粒径 | 90 µm (45-165 µm) |
| 配体 | NTA |
| 载量 | ≥50 mg/ml，即50mg含 His标签的目的蛋白（34KD）/ml填料 |
| 存储溶液 | 20% 乙醇（纯填料体积占比50%） |
| 存储温度 | 2-8°C，避免冻存 |
| 重复使用次数 | 可重复多次使用 |
应用案例
1、实验条件
- 仪器：蠕动泵，玻璃层析柱
- 样品：Recombinant Protein A in E.coli extract (目的蛋白分子量：34KD)
- 样品体积：21L 大肠杆菌裂解液（菌泥来自70L*2发酵罐）
- 柱体积：约4.1L（D: 200mm; H: 13.1cm）
- 平衡：60 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0；流速500ml/min，5倍柱体积
- 上样：60 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0；流速500ml/min
- 洗杂：60 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10-20 mM imidazole, pH 8.0；流速700ml/min，10倍柱体积
- 洗脱：60 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0；流速500ml/min
- 溶液置换：透析或超滤至1*PBS溶液中
2、实验结果
图1. L00666纯化测试SDS-PAGE分析图
实验结果说明：Ni-NTA纯化载量高，结合力强，纯度高
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Ni-TED填料
High Affinity Ni-TED Resin FF (L00885）是一款新型的固定化金属螯合层析（IMAC）填料，是将TED偶联至6%琼脂糖凝胶介质上，通过五个配位键螯合Ni2+离子。该填料主要用于捕获和纯化分泌到真核表达培养基上清中的组氨酸标签（His-tag）蛋白。与其它螯合剂填料相比，High Affinity Ni-TED resin具有更强的组分兼容性，可以在含有一定浓度的EDTA及DTT的情况下进行目的蛋白的高效纯化。
表2. Ni-TED亲和层析介质的特性
| 骨架基质 | 高交联的6%琼脂糖凝胶 |
| 平均粒径 | 90μm (45～165 μm) |
| 配体 | TED |
| 动态载量 | 10 mg/ml ，即10mg含His标签的目的蛋白（34KD）/ml 填料 |
| 耐受压力 | 0.3MPa, 3 bar |
| 推荐流速 | 150-600cm/h |
| 储存溶液 | 20%乙醇（纯填料体积占比50%） |
| 储存温度 | 2～8℃，避免冻存 |
| 重复使用次数 | 可重复多次使用 |
应用案例
图2. Ni-NTA和Ni-TED耐受化学试剂的对比实验
实验结果说明：Ni-TED对化学试剂的耐受性略高于Ni-NTA
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分离磁珠
AmMag™ Ni Magnetic beads（L00776）磁珠用于纯化和筛选组氨酸标签（His-tag）蛋白。这个磁珠具有高度的EDTA和DTT 抗性，能在螯合剂存在的情况下，与蛋白质结合。这个磁珠经过优化，易于清洗和再生，可重复用于多个样品。磁珠适合用于纯化稀释样品中的蛋白、低表达量的蛋白及pull-down实验，也可配套SA Plus磁珠纯化仪进行高通量的His标签蛋白和抗体的纯化。
表3. Ni-TED磁珠的特性
| 骨架基质 | 4%交联度的琼脂糖磁珠 |
| 平均粒径 | 70μm |
| 配体 | TED |
| 载量 | 10 mg/ml即10mg含His标签的目的蛋白（34KD）/ml 填料 |
| 存储溶液 | 20%乙醇 （纯磁珠体积占比25%) |
| 存储温度 | 2–8°C，避免冻存 |
| 重复使用次数 | 可重复多次使用 |
应用案例
AmMag™ Ni Magnetic beads用 1M NaOH 处理 100 次循环后，继续用于纯化大肠杆菌裂解液中的His标签蛋白。
1、实验材料
- 大肠杆菌裂解液（每 100ul磁珠5ml目标蛋白，保证目的蛋白过量）
- 未用NaOH处理的Ni-TED磁珠（100ul），经过100次NaOH处理后的Ni-TED磁珠（100ul）
- 裂解/洗涤缓冲液：20 mM Na2HPO4，0.15 M NaCl，pH 7.0
- 洗脱缓冲液：20 mM Na2HPO4、0.15 M NaCl、0.5M 咪唑 pH 7.0
2、实验结果
图3. Ni-TED磁珠耐受NaOH处理的对比实验
实验结果说明：Ni-TED磁珠在经过1M NaOH循环处理100次后，不论上样样品是否含EDTA+DTT，磁珠的载量以及纯化蛋白的纯度，都和未处理前一样，没有明显区别。Ni-TED磁珠的化学试剂耐受性高。
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预装柱（1ml和5ml）
5ml和1ml预装柱可用于AKTA和与AKTA类似的自动纯化系统。1ml预装柱的最佳流速为1ml/min，5ml预装柱的最佳流速为5ml/min。为了保持预装柱的完整性，1ml预装柱的流速不要超过4ml/min，5ml预装柱的流速不要超过15ml/min（测试条件：室温，流动相为水性缓冲液，报警压力为 0.3 兆帕）。
金斯瑞提供的预装柱有：Ni-IDA Resin FF预装柱（ L00684）和Ni-NTA预装柱High Affinity Ni-Charged Resin FF Prepacked Column（ L00683）。
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His标签蛋白纯化填料及磁珠选择指南
| 产品名称 | 配基 | 基质 | 动态载量 | 产品编号 | 应用 |
|---|---|---|---|---|---|
| High Affinity Ni-TED Resin FF | TED | 6%琼脂糖 | 10mg/ml | L00885 New | 重力柱纯化 & 仪器纯化，纯度高，化学试剂耐受性更强 |
| High Affinity Ni-Charged Resin FF | NTA | 6%琼脂糖 | ≥50mg/ml | L00666 Hot | 重力柱纯化 & 仪器纯化，载量很高，纯度很高，性价比高 |
| Ni-NTA Resin | NTA | 4%琼脂糖 | >20mg/ml | L00250 | 重力柱纯化，载量较高，纯度较高 |
| Ni Resin FF | IDA | 6%琼脂糖 | >40mg/ml | L00465 | 重力柱纯化 & 仪器纯化，载量较高，成本较低 |
| Ni-IDA Resin | IDA | 4%琼脂糖 | 20mg/ml | L00223I | 重力柱纯化，载量高，成本很低 |
| 预装柱 | |||||
| 产品名称 | 配基 | 基质 | 动态载量 | 产品编号 | 应用 |
| High Affinity Ni-Charged Resin FF Prepacked Column | NTA | 6%琼脂糖 | >40mg/ml | L00683 | 仪器纯化，载量高，纯度很高 |
| Ni-IDA Resin FF Prepacked Column | IDA | 6%琼脂糖 | >40mg/ml | L00684 | 仪器纯化，载量较高 |
| 纯化分离磁珠 | |||||
| 产品名称 | 配基 | 基质 | 参考载量 | 产品编号 | 应用 |
| AmMag™ Ni Magnetic beads | TED | 超顺4%琼脂糖磁珠 | 10mg/ml | L00776 New | 磁力架或纯化仪器，纯度高，化学试剂耐受性强 |
| Ni-charged MagBeads | NTA | >40mg/ml | L00295 | 磁力架或纯化仪器，载量高，纯度高 | |
