基因编辑FAQs

CRISPR实验递送体系的选择

• Q1. CRISPR/Cas9如何修饰真核基因组？

  针对目标序列设计的gRNA与Cas9结合，并将Cas9引导到目标序列，目标序列的PAM序列上游3-4个碱基处，Cas9切割产生双链断裂（DSB）。

  两种方法可以修复双链断裂：1. 如果不提供修复模板或供体DNA，则会通过易出错的非同源末端连接 (NHEJ) 进行重新链接，产生插入缺失从而敲除蛋白质。2. 如果提供修复模板或供体DNA，则会通过同源重组(HDR)方式修复双链断裂，以准确敲入目标基因。

  
• Q2. CRISPR实验如何选递送体系？

  易转染的细胞系可以选择质粒，转染效率低的细胞系建议选择病毒，期望达到编辑效率更高、毒性更低的效果可以选择RNP（即sgRNA+Cas9蛋白）的递送系统。

• Q3. 质粒递送体系中，all-in-one载体和双载体如何选择？

  All-in-one载体系统有两个主要优点：

  • 只需转染一次宿主细胞
  • 以1:1的比例进行gRNA和Cas9的导入

  双载体中，Cas9和gRNA在不同的载体上独立表达。如果您计划表达多个gRNA以进行多重靶向，双载体会更合适。对于这些应用，Cas9应首先在细胞系中稳定表达，然后可以用不同的gRNA载体转染细胞以构建细胞库。

• Q4. 什么时候需要慢病毒或腺相关病毒（AAV）载体？

  CRISPR 基因编辑的载体选择应考虑应用和细胞类型。

  • 在大多数易于转染的细胞系中，非病毒载体可以发挥很好的作用。
  • 慢病毒转染可以用在瞬时转染效率低的细胞中，例如原代细胞培养物或难以转染的细胞系。
  • AAV载体具有低免疫原性，是体内基因传递的较佳选择。由于AAV载体的载量限制通常小于其他载体（<5 kb），将SpCas9基因包装到这些载体中可能具有挑战性。金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）比SpCas9小，是AAV载体的首选Cas9。
• Q5. 直接导入Cas9蛋白效果比用质粒DNA编码Cas9蛋白更好吗？

  直接使用Cas9蛋白或RNP的优势有：

  • 提高编辑效率：RNP中Cas9蛋白与sgRNA复合物结合率更高、更稳定；
  • 降低脱靶效应：质粒表达和消除可能受非预期因素干扰，而RNP中Cas9蛋白与sgRNA是非持续表达，结合后转导入宿主细胞，避免切割非靶序列；
  • 无DNA干扰：质粒本质是DNA，DNA可能随机插入宿主DNA的断裂处；
  • 无免疫原性：Cas9蛋白较之质粒，不易引起宿主细胞免疫反应，避免细胞因子等干扰；
  • 简便快捷：RNP转导后即可进行基因编辑，1天后可检测到编辑效率，自动降解。

CRISPR实验关键试剂的选择

• Q6. 化学合成的sgRNA与利用体外转录（IVT）sgRNA有什么区别？

  化学合成sgRNA主要有以下优势：

  • 编辑效率高：金斯瑞研发和Nat. Biotechnol等文献均发现化学合成sgRNA的编辑效率高于体外转录sgRNA；
  • 细胞毒性低：体外转录sgRNA带有5'三磷酸修饰，会引起细胞免疫反应，造成细胞毒性，干扰后续实验，而化学合成的sgRNA则不存在该干扰因素；
  • 更稳定：化学合成sgRNA可添加硫代和甲氧基修饰，使其在储存和试验中更稳定，且化学合成工艺的稳定性和一致性优于生物合成，可以保证下游实验的可重复性；
  • 操作简单：化学合成sgRNA即买即用，体外转录sgRNA需要2-3天、5-6步合成操作，经济和时间成本高。
• Q7. 使用合成sgRNA与使用crRNA:tracrRNA双链体有什么不同？

  使用sgRNA时，无需在使用前对crRNA和tracrRNA双链体进行退火。更重要的是，几项研究表明，当与Cas9共同作用时，长单链sgRNA比crRNA：tracrRNA具有更好的稳定性，从而有更高的编辑效率^{1, 2}。

  1. Hendel, et al., Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat. Biotechnol., 33 (2015) 985-989.
  2. Ryan et al., Improving CRISPR–Cas specificity with chemical modifications in single-guide RNAs. Nucleic Acids Research, 46 (2018) 2: 792–803.
• Q8. gRNA序列应该如何设计？

  设计您的gRNA序列包括4个步骤：

  1. 确定目标基因位点。
  2. 寻找适合gRNA靶向的序列。
  3. 检查脱靶结合的可能性。
  4. 选择位于结合区域内的gRNA序列。

  通过提供脱靶评分和染色体位置，金斯瑞的gRNA数据库和在线设计工具将消除您在选择gRNA序列时的疑虑，建议使用3个gRNA序列，以确保敲除和实验准确性。

• Q9. 进行CRISPR介导的基因KI时，如何从各种HDR模板中进行选择？我应该选择双链DNA、质粒DNA还是单链DNA？

  这取决于实验目的和宿主细胞类型。与双链DNA供体相比，单链DNA表现出显著提高编辑效率和特异性，以及减少脱靶整合的优势，尤其是在编辑原代细胞、干细胞和开发转基因动物模型方面。

  	质粒DNA	dsDNA	ssDNA
  敲入效率	中等	高	高
  脱靶效应	中等	高	低
  细胞毒性	高	高	低
  成本	低	中等	较高

• Q5. 金斯瑞为单链DNA模板提供哪些质量控制检测？
  1. Sanger测序，以确保单链DNA序列的准确性；
  2. 通过凝胶电泳对最终单链DNA产品进行纯度测试。

  在单链DNA的生产过程中，我们进行了两轮测序，以保证序列的准确性。我们首先通过测序选择经过序列验证的质粒DNA模板，以确保最终单链DNA产品的纯度和序列准确性。此外，我们对最终的单链DNA产品使用直接测序来确认单链DNA产品的序列正确性。最终的单链DNA产品仅包含全长、经过序列验证的单链DNA分子。通过使用我们专有的、正在申请专利的酶合成方法，金斯瑞提供的单链DNA产品不含双链DNA。

脱靶效应的检测与规避方案

• Q11. 影响CRISPR靶向性效率和特异性的因素有哪些？

  影响CRISPR靶向效率和特异性的因素有：

  • gRNA设计：金斯瑞开发的gRNA设计软件基于NCBI权威文献开发和验证的算法，选择合适目标序列以避免脱靶效应，该算法在目标基因中寻找一个约20bp的序列，在其他位置没有出现与其高度相似的序列。因为gRNA和非目标的内源基因组之间的错配数小于3个时，可能发生Cas9介导的脱靶效应。
  • 核酸酶/靶向策略：大多数研究使用从化脓性链球菌中分离的Cas9核酸酶。Cas9 WT诱导双链断裂，通常通过非同源末端连接（NHEJ）修复，这会引入导致移码和蛋白质表达完全丧失的小段基因嵌入或缺失，这已被证明是在每个细胞系和生物体中引入表型敲除的一种简单有效的方法。另一种策略是使用这种酶的突变体Cas9-D10A（切口酶），它可用于在目的区域两侧诱导两条单链断裂，以进行更特异的敲除。如果您需要用于不同酶的gRNA序列，或者您对CRISPR靶向策略有其他特殊要求，请发送邮件至oligo@genscript.com.cn咨询。
  • gRNA序列的数量：通常单个gRNA足以敲除目标基因；但是，我们建议您为每个目标基因订购三个序列的gRNA，以提高基因组编辑的成功率，避免出现脱靶效应。

  在金斯瑞订购 gRNA质粒，我们会提供一个经过序列验证的质粒，其中包含gRNA表达和基因组结合所需的所有元素：U6启动子、间隔（目标）序列、gRNA骨架和终止子。我们保证提供的gRNA克隆序列准确；然而，鉴于构建基因组编辑细胞系以及转染和实验的复杂性，我们无法保证使用我们的gRNA进行实验的结果。如果您希望使用CRISPR技术创建经过序列验证的KO或KI细胞系，请参阅GenCRISPR™基因编辑细胞系服务。

• Q12. 如何降低脱靶效应？

  降低脱靶效应的方法：

  1. 选择特异的gRNA；
  2. 使用RNP；
  3. 使用eSpCas9；
  4. 使用Nickase Cas9；
• Q13. 如何检测是否发生脱靶？

  基因编辑的脱靶率检测一般有两种方法：

  1. 选择潜在的脱靶位点，例如选择gRNA预测网站上Top 5潜在脱靶位点，进行Sanger测序单克隆；
  2. 预算允许的情况下，通过全基因组测序的方法进行全基因组序列的分析和比对更精准，例如基于NGS的iGUIDE方法。

CRISPR实验的技巧

• Q14. 转染或导入效率低怎么优化？

  一般来说主要通过以下方法：

  • 测试不同的转染试剂，如不同厂家的Lipo产品；
  • 测试不同的电转条件，如不同的电压或者电转buffer；
  • 测试不同的病毒感染条件，比如不同MOI，不同的Polybrene浓度。
• Q15. 设计有效的单链DNA模板有哪些技巧？

  对于点突变，建议使用非对称单链DNA设计。对于大片段基因插入，有报道显示插入基因侧翼长度可从300到1000bp。在大多数情况下，500bp长度的同源臂就可以了。需要注意的是设计需要包含沉默突变的ssDNA模板，使sgRNA PAM序列发生突变，以避免二次切割。KI供体设计可能很复杂。强烈建议使用软件（例如 snapgene）来查看和编辑序列。您可以阅读以下文章以获取更多设计技巧。

  Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology.

• Q16. 提高CRISPR KI效率的小技巧
  1. sgRNA切割位点应靠近突变位点，一般情况，15bp 之内编辑效果较好。
  2. 在转染gRNA/Cas9和供体模板之前优化转染效率。
  3. 使用FACS筛选转染的细胞。
  4. 如果允许的话，使用药物或标记来选择 KI 克隆（例如，在插入基因的 C 端标记嘌呤霉素抗性基因以进行选择）。

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