gRNA constructs

CRISPR/Cas9基因组编辑-gRNA质粒构建

CRISPR/Cas9是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。只需要在细胞中导入合成的sgRNA或sgRNA表达载体,即可配合同时表达的Cas9核酸酶,对任何物种的基因组进行高效率的定向编辑。相比于ZFN系统和TALEN系统,CRISPR/Cas9是目前操作超便捷,耗时足够短且效率足够高的基因组定点编辑技术。

金斯瑞为您提供的CRISPR材料源于张峰实验室研发,所提供的CRISPR产品和服务得到美国 Broad 研究所授权许可,包括:

质粒构建选择

服务优势

应该选择哪种gRNA

随着CRISPR/Cas9基因组编辑技术的持续火热,对gRNA质粒载体的数量也相应增加。不同CRISPR载体具有不同的优点,取决于您的实验系统和下游的应用。

如何设计gRNA序列? 设计gRNA序列包括四个步骤:(1)确定靶基因的位置;(2)寻找Cas9靶向的适当序列;(3)检测脱靶效应;(4)选择能恰当结合目标位置的gRNA。金斯瑞gRNA数据库和在线设计工具能够提供脱靶评分和染色体位置信息,帮您在选择gRNA序列时,避免许多臆测性的工作。了解更多gRNA序列设计实例信息,请点击此处

选择all-in-one载体还是双载体系统?大多数情况下,无论使用非病毒或慢病毒转染方法,优先选用all-in-one载体系统。优点是只需要转染一次,gRNA和Cas9表达为1:1比例。载体上通常包含选择标记,如抗生素抗性或荧光蛋白标记,能够更方便地选择阳性克隆。Cas9和gRNA在不同载体上分开表达的双载体系统,更适用于靶向多个gRNA。这种情况下,Cas9能够先在细胞系中稳定表达,然后转染多个不同的gRNA载体,形成一个细胞库或gRNA库。

什么情况下需要慢病毒载体或腺相关病毒载体? 基因组编辑的质粒构建方式选择,取决于细胞类型和应用。对于许多易于转染的细胞系,用于一般筛选目的,非病毒载体能够很好的起作用。慢病毒转染通常用于原代细胞培养和难转染的细胞中,具有较低的瞬时转染效率。使用all-in-one载体或双载体系统,取决于是否应用于建立单靶点敲除细胞系或细胞库。腺相关病毒(AAV)载体具有低的免疫原性,更适用于体内基因delivery. 由于AAV载体的装载容量通常比其它载体小,约为4.5 kb,将SpCas9重组进这种载体有一定的困难。SaCas9比SpCas9更小,更适用于AAV包装。

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