SAM Constructs

CRISPR/Cas9协同激活介质(SAM)- 高效激活转录

通过修饰CRISPR/Cas9系统中的一些元件,形成一种蛋白复合物-协同激活介质(SAM),能高效激活同一细胞单个或多达10个内源基因的转录。Cas9内切活性丧失,成为dCas9(dead Cas9),dCas9在gRNA的导向下仍能靶向内源基因组的特定位点,因而SAM具有很好的特异性。拥有Broad研究所的专利许可*,金斯瑞可为您提供经过验证的靶向人基因组任何编码区的SAM gRNA序列;亦可为您免费设计其它种属基因组的SAM gRNA序列。SAM gRNA序列合成并克隆至高效的慢病毒表达载体中,与 Cas9-VP64 及MS2-P65-HSF1两个组件,三者组成了SAM系统。

SAM载体选择

金斯瑞提供SAM复合物中的sgRNA,合成并克隆至慢病毒表达载体,同时另随货dCas9-VP64及 MS2-p65-HSF1慢病毒表达载体。

载体名称 筛选标记 载体图谱
pLenti sgRNA(MS2)_zeo Zeo pLenti sgRNA(MS2)_zeo
sgRNA(MS2) New! Amp sgRNA(MS2)
pLenti dCas-VP64_Blast Blast pLenti dCas-VP64_Blast
pLenti dCas9-VP64_GFP New! GFP pLenti dCas9-VP64_GFP
pLenti MS2-P65-HSF1_Hygro Hygro pLenti MS2-P65-HSF1_Hygro
pLenti MS2-P65-HSF_GFP New! GFP pLenti MS2-P65-HSF_GFP

关于SAM

SAM系统具有转录激活功能,需要三个组成部分:
  • dCas9与VP64的激活区结合:Cas9内切活性丧失,形成dCas9,不切割DNA链,但仍能与靶区域结合。dCas9与转录激活域 (vp64)进行融合。VP64与p65及HSF1协同作用,增强内源基因的转录。
  • sgRNA四环和第二个茎环上附加小发夹适配子:基于sgRNA的设计,最终复合物靶向内源基因转录起始位点(Transcriptional Start Site (TSS))的-200bp处,上调基因表达。通常sgRNA与Cas9结合形成Cas9-sgRNA复合物,而MS2 RNA适配子使得SAM系统的第三个组件能与Cas9-sgRNA复合物结合。
  • MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白:MS2蛋白与p65及HSF1转录激活域融合后形成MS2-P65-HSF1,VP64协同转录激活域p65及HSF1,MS2与sgRNA-dCas9复合物结合,从而提高dCas9介导的基因活化效率。

上述三个组件分别克隆至不同的慢病毒表达载体(如下),三个载体只有同时转导入细胞中,SAM才能发挥活性。


如何设计SAM中的sgRNA

SAM复合物靶向内源基因的编码区,上调内源基因的表达。设计的sgRNA可靶向内源基因转录起始位点(Transcriptional Start Site (TSS))的-200bp处,合成后并克隆至lenti sgRNA(MS2)_zeo载体中。

人基因组范围的SAM gRNA 数据库为人基因组的每个编码区设计了6条SAM gRNA。我们推荐针对每条基因至少选择2或3条sgRNA。如果您需靶向其它种属的SAM gRNA,我们将为您免费进行设计。

对SAM功能进行改变,通过设计靶向内源基因转录起始位点(Transcriptional Start Site (TSS))的-200 bp处的sgRNA. 例如,调节转录激活的程度,您可设计gRNA靶向内源基因转录起始位点(Transcriptional Start Site (TSS))上游更远的距离。如需抑制转录,设计的gRNA靶向相对TSS区+50 bp处,从而有效抑制TSS的激活

客户应明确知晓上述对试剂用途的限制,并自行承担因违反该限制而产生的法律责任。

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