CRISPR Nickase constructs

CRISPR Nickase载体

相比较于其它的基因编辑方法,CRISPR/Cas9技术的特异性更好些,但脱靶效应也不可忽视。为提高特异性,对Cas9的内切酶活性进行了改造。WT Cas9有两个催化结构域,RuvC和HNH,对这些结构域内的催化位点残基进行突变(RuvC中的D10A和HNH中的H840A)。改造后的Cas9能够让DNA单链断裂,而不是双链断裂(Ran et al, 2013) (Figure 1).这种Cas9具有切口酶活性称为Cas9n,由gRNA指导,靶向于基因组DNA的正负双链。细胞会优先通过HDR修复SSBs,而不是NHEJ。通过HDR机制修复,能够降低脱靶造成的插入缺失突变。金斯瑞能够提供Broad专利授权的nickase载体用于哺乳动物细胞基因组编辑。


Nickase



Figure 1: Increasing on-target specificity with Nickase (Cas9n D10A) pairs


什么情况选择nickase载体?

由于具有更好的特异性,nickase载体更适用于对脱靶效应更敏感的基因编辑实验。但是,需要设计两条gRNA,靶向于目的基因的正向和反向链,而且它们的PAM位点必须在彼此的外侧远端(Mali et al, 2013)。研究发现,两条gRNA之间的位置间距为100 bp以内,CRISPR活性都会是有效的(Ran et al, 2013)。

哪种载体适合实验?

金斯瑞提供两种nickase载体可供选择:all-in-one载体和单独载体。all-in-one载体为SpCas9n-BB-PX460和SpCas9n-BB-P2A-GFP-PX461,适用于单个基因编辑,SpCas9n-BB-P2A-GFP-PX461含有一个GFP标签用于检测。pLentiGuide-Puro和plentiCas9n(D10A)-Blast为双载体系统,适用于细胞库构建或gRNA文库构建。慢病毒载体与第2代及第3代慢病毒包装质粒能够兼容。

Nickase质粒构建

Vector type Vector Name gRNA promoter All-in-one vector? Selection/Screening Markers Vector Map Vector Price
Non-viral pSpCas9n-BB (PX460) U6 Yes
Driven by CBh promoter, with N-terminal DYK & NLS
AmpR pSpCas9n-BB (PX460) vector map Free!

整个服务价格包括了克隆费用,无需额外收费
pSpCas9n-BB-2A-GFP (PX461) U6 Yes
Driven by CBh promoter, with N-terminal DYK & NLS
AmpR, GFP pSpCas9n-BB-2A-GFP (PX461) vector map
pSpCas9n-BB-2A-Puro (PX462) U6 Yes
Driven by CBh promoter, with N-terminal DYK & NLS
AmpR, Puro pSpCas9n-BB-2A-Puro (PX462) vector map
Lentiviral pLentiGuide-Puro U6 No
plentiCas9n(D10A)-Blast is provided free-of-charge for co-delivery
AmpR, BleoR pLentiGuide-Puro vector map

服务交付

注:如需制备其它规格或转染级的质粒,需额外收费,详情可查看金斯瑞质粒DNA制备服务

References:

客户应明确知晓上述对试剂用途的限制,并自行承担因违反该限制而产生的法律责任。


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