CRISPR Case Studies and FAQs

CRISPR KO Cell Line案例研究

  • 案例分享1
    • 在4号外显子中通过插入缺失,敲除人类结肠癌细胞HCT116中的K-ras位点,如图1所示。
    • 对Cas9和gRNA递送颗粒进行慢病毒包装,HCT116细胞进行病毒滴度优化。对每个单克隆进行Sanger测序,选择K-ras基因在第4号外显子上敲除的纯合子,如图2所示。
    • 通过Western Blot方法验证所选克隆中K-ras基因表达缺失,如图3所示。

    图1:K-ras敲除方法

    图2:亲代细胞和K-ras-/-HCT116细胞sanger测序

    图3:K-ras敲除蛋白表达验证

  • 案例分享2
    • 设计并合成gRNA,以靶向GS等位基因上的特定区域。用该载体转染DG44细胞,并通过Sanger测序分析细胞池。
    • 获得了几个单克隆并进行Sanger序列分析。一个单克隆包含移码突变(图1)。
    • 分析GS敲除克隆的GS蛋白表达(图2)。
    • 为了评估功能丧失,在有或没有谷氨酰胺浓度增加的情况下培养GS敲除克隆(图3)。在没有谷氨酰胺的情况下GS敲除克隆不能生长。在增加谷氨酰胺时GS敲除克隆生长,因此确定GS敲除细胞系的功能缺失。
    • 总之,成功靶向GS产生的单克隆已完全验证GS功能的缺失。

    图1:GS等位基因缺失引起移码突变

    图2:在GS敲除细胞裂解液中,anti-GS抗体未检测到谷氨酰胺合成酶

    图3:DG44(GS-/-)的L-谷氨酰胺依赖性

  • 案例分享3
    • 设计一对gRNA靶定基因组上的基因进行全基因缺失。使用GenCRISPR™技术优化gRNA对,对Jurkat细胞的切割效率最大(图1)。
    • 配对的gRNAs共转染到Jurkat细胞中,并通过FACS分选富集。通过PCR评估缺失效率,根据条带灰度计算,转染细胞池占21%(图2)。
    • 采用高通量PCR方法筛选到了200个单克隆,并通过Sanger测序和RT-PCR验证全等位基因缺失克隆(图3)。

    图1:

    图2:PCR验证gRNA对

    图3:缺失克隆筛选

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